1、簡述
紫外一可見分光光度法是通過被測物質(zhì)在紫外光區(qū)或可見光區(qū)的特定波長處或一定波長范圍內(nèi)的吸光度，對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。本法在檢驗(yàn)中主要用于物質(zhì)的鑒別、檢查和含量測定。
定量分析通常選擇物質(zhì)的*大吸收波長處測出吸光度，然后用對(duì)照品或吸收系數(shù)求算出被測物質(zhì)的含量，多用于制劑的含量測定;對(duì)已知物質(zhì)定性可用吸收峰波長或吸光度比值作為鑒別方法;若該物質(zhì)本身在紫外光區(qū)無吸收，而其雜質(zhì)在紫外光區(qū)有相當(dāng)強(qiáng)度的吸收，或雜質(zhì)的吸收峰處該物質(zhì)無吸收，則可用本法作雜質(zhì)檢查。
物質(zhì)對(duì)紫外輻射的吸收是由于分子中原子的外層電子躍遷所產(chǎn)生，因此，紫外吸收主要決定于分子的電子結(jié)構(gòu)，故紫外光譜又稱電子光譜。有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)中如含有共扼體系、芳香環(huán)等發(fā)色基團(tuán)，均可在紫外區(qū)(200-400nm)或可見光區(qū)(400-850nm)產(chǎn)生吸收。通常使用的紫外一可見分光光度計(jì)的工作波長范圍為190-900nm。
紫外吸收光譜為物質(zhì)對(duì)紫外區(qū)輻射的能量吸收圖。朗伯一比爾(Lambert一Beer)定律為光的吸收定律，它是紫外分光光度法定量分析的依據(jù)，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為
式中A為吸光度;
T為透光率;
E為吸收系數(shù);
c為溶液濃度;
l為光路長度。
如溶液的濃度（c）為1%（gml)，光路長度(l)為1cm，相應(yīng)的吸光度即為吸收系數(shù)，以Ecl表示。如溶液的濃度(c)為摩爾濃度(molL)，光路長度為1cm時(shí)，則相應(yīng)的吸收系數(shù)為摩爾吸收系數(shù)，以ε表示。
2、儀器
紫外一可見分光光度計(jì)主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、記錄儀、顯示系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等部分組成。
為了滿足紫外一可見光區(qū)全波長范圍的測定，儀器備有兩種光源，即氛燈和碘鎢燈，前者用于紫外區(qū)，后者用于可見光區(qū)。
單色器通常由進(jìn)光狹縫、出光狹縫、平行光裝置、色散元件，聚焦透鏡或反射鏡等組成。色散元件有棱鏡和光柵兩種，棱鏡多用天然石英或熔融硅石制成，對(duì)200-400nm波長光的色散能力很強(qiáng)，對(duì)600nm以上波長的光色散能力較差，棱鏡色散所得的光譜為非勻排光譜。光柵系將反射或透射光經(jīng)衍射而達(dá)到色散作用，故常稱為衍射光柵，光柵光譜是按波長作線性排列，故為勻排光譜，雙光束儀器多用光柵為色散元件。
檢測器有光電管和光電倍增管兩種。
紫外一可見分光光度計(jì)依據(jù)其結(jié)構(gòu)和測量操作方式的不同可分為單光束和雙光束分光光度計(jì)兩類。單光束分光光度計(jì)有些仍為手工操作，即固定在某一波長，分別測量比較空白、樣品或參比的透光率或吸光度，操作比較費(fèi)時(shí)，用于繪制吸收光譜圖時(shí)很不方便，但適用于單波長的含量測定。雙光束分光光度計(jì)藉扇形鏡交替切換光路使分成樣品(S）和參比(R)兩光束，并先后到達(dá)檢測器，檢測器信號(hào)經(jīng)調(diào)制分離成兩光路對(duì)應(yīng)信號(hào)，信號(hào)的比值可直接用記錄儀記錄，雙光束分光光度計(jì)操作簡單，測量快速，自動(dòng)化程度高，但作含量測定時(shí)，為求準(zhǔn)確起見，仍宜用固定波長測量方式。
3、紫外一可見分光光度計(jì)的檢定
3.1波長準(zhǔn)確度
3.1.1波長準(zhǔn)確度的允差范圍
紫外一可見分光光度計(jì)波長準(zhǔn)確度允許誤差，紫外區(qū)為±lnm,500nm處±2nm。
3.1.2波長準(zhǔn)確度檢定方法
3.1.2.1用低壓汞燈檢定
關(guān)閉儀器光源，將汞燈(用筆式汞燈*方便)直接對(duì)準(zhǔn)進(jìn)光狹縫，如為雙光束儀器，用單光束能量測定方式，采用波長掃描方式，掃描速度“慢”(如15nmmin)、響應(yīng)“快”、*小狹縫寬度(如0,lnm)、量程。0-*，在200-800nm范圍內(nèi)單方向重復(fù)掃描3次，由儀器識(shí)別記錄各峰值(若儀器無“峰檢測”功能，必要時(shí)可對(duì)指定波長進(jìn)行“單峰”掃描)。
單光束儀器以7516型為例，可將選擇開關(guān)放在X 0.1位置，透光率讀數(shù)放在100(或選擇開關(guān)放在X1，透光率放在10)，關(guān)小狹縫，打開光閘門，緩緩轉(zhuǎn)動(dòng)波長盤，尋找汞燈546.07nm峰出現(xiàn)的位置，若與波長讀數(shù)不符，應(yīng)調(diào)節(jié)儀器左側(cè)準(zhǔn)直鏡的波長調(diào)整螺絲，如波長向短波長方向移動(dòng)，應(yīng)順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)波長調(diào)整螺絲，如向長波方向移動(dòng)，則應(yīng)反時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)波長調(diào)整螺絲，調(diào)整好后，再按汞燈的下列譜線測試，記錄每條譜線與儀器波長讀數(shù)的誤差。
用于檢定紫外一可見分光光度計(jì)的汞燈譜線波長237.83,253.65,275.28,296.73,302.15,313.16,334.15,365.02,365.48,366.33,404.66（紫色)、435.83（藍(lán)色)、546.07(綠色),576.96(黃色)及579.07nm。
3.1.2.2用儀器固有的氘燈檢定
本法主要用于日常工作中波長準(zhǔn)確度的核對(duì)。取單光束能量測定方式，測量條件同上述低壓汞燈的方法，對(duì)486.02nm及656.lOnm二單峰進(jìn)行方向重復(fù)掃描3次。
3.1.2.3用氧化鈥玻璃檢定
將氧化鈥玻璃放人樣品光路，參比光路為空氣，按測定吸收光譜圖方法測定。校正自動(dòng)記錄儀器時(shí)，應(yīng)考慮記錄儀的時(shí)間常數(shù)，測定樣品與校正時(shí)取同一掃描速度。氧化鈥玻璃在279.4,287.5,333.7,360.9,418.7,460.0,484.5,536.2及637.5nm波長處有尖銳的吸收峰，可供波長檢定用。氧化鈥玻璃因制造的原因，每片氧化鈥的吸收峰波長有差異，另外，在放置過程中也會(huì)發(fā)生波長漂移，因此需定期由計(jì)量部門校驗(yàn)。
3.1.2.4用高氯酸欽溶液檢定
本法可供沒有單光束測定功能的雙光束紫外分光光度計(jì)波長準(zhǔn)確度檢定用。
高氯酸欽溶液的配制方法取10%高氯酸為溶劑，加人氧化鈥(Ho2 03)配成4%溶液即得。高氯酸欽溶液較強(qiáng)的吸收峰波長為241.13,278.10,287.18,333.44,345.47,361.31,416.28,451.30,485.29,536.64,640.52nm。
如果是雙光束掃描儀器，但不是數(shù)據(jù)貯存型的(指是直接將信號(hào)描記于記錄紙上)，記錄的波長可能因記錄筆滯后而非真實(shí)波長，為了準(zhǔn)確測定，建議采用定點(diǎn)檢定而不用掃描方式。
3.2吸光度準(zhǔn)確度
精密稱取在120℃干燥至恒重的基準(zhǔn)重鉻酸鉀約60mg，置1000m1量瓶中，用0.005mo1L硫酸液溶解并稀釋至1000m1，用配對(duì)的1 cm石英池，以0.005mo1L硫酸液為空白，在235,257,313,350nm分別測定吸光度，然后換算成E，測得值應(yīng)符合表1中規(guī)定的允差范圍。
分辨率、基線平直度、穩(wěn)定度、絕緣電阻等項(xiàng)檢定，按現(xiàn)行*技術(shù)監(jiān)督局“雙光束紫外一可見分光光度計(jì)檢定規(guī)程”檢定，應(yīng)符合有關(guān)項(xiàng)下的規(guī)定。日常使用中，對(duì)以上兩項(xiàng)，即波長和吸光度準(zhǔn)確度應(yīng)根據(jù)需要隨時(shí)檢查。
3. 3雜散光的檢查
可按表2所列的試劑和濃度，配制成水溶液，置1 cm石英池中，在規(guī)定的波長處測定透光率，應(yīng)符合表2中規(guī)定。
4、樣品測定操作方法
4.1吸收系數(shù)測定(性狀項(xiàng)下)
按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法配制供試品溶液，在規(guī)定的波長處(參見5.8項(xiàng))測定其吸光度，并計(jì)算吸收系數(shù)，應(yīng)符合規(guī)定范圍。
4.2鑒別及檢查
按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，測定供試品溶液的*大及*小吸收波長，有的必須測定其在*大吸收波長與*小吸收波長處的吸光度比值，均應(yīng)符合規(guī)定。
4.3含量測定
4.3.1對(duì)照品比較法
按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法，分別配制供試品溶液和對(duì)照品溶液，對(duì)照品溶液中所含被測成分的量應(yīng)為供試品溶液中被測成分標(biāo)示量的*土10%以內(nèi)，用同一溶劑，在規(guī)定的波長處測定供試品溶液和對(duì)照品溶液的吸光度。
4.3.2吸收系數(shù)法
按各品種項(xiàng)下配制供試品溶液，在規(guī)定的波長及該波長士2 nm處測定其吸光度，按各該品種在規(guī)定條件下給出的吸收系數(shù)計(jì)算含量。用本法測定時(shí)，吸收系數(shù)通常應(yīng)大于100，并注意儀器的校正和檢定，如測定新品種的吸收系數(shù)，需按后列“吸收系數(shù)測定法”的規(guī)定進(jìn)行。
4.3.3計(jì)算分光光度法
按規(guī)定，計(jì)算分光光度法一般不宜用于含量測定，對(duì)于少數(shù)采用計(jì)算分光光度法的品種，應(yīng)嚴(yán)格按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法進(jìn)行。用本法時(shí)應(yīng)注意有一些吸光度是在待測成分吸收曲線的上升或下降陡坡處測定，影響精度的因素較多，故應(yīng)仔細(xì)操作，盡量使供試品和對(duì)照品的測定條件一致。若該品種不用對(duì)照品，如維生素A測定法，則應(yīng)在測定前對(duì)儀器作仔細(xì)的校正和檢定。
4.3.4比色法
供試品本身在紫外一可見光區(qū)沒有強(qiáng)吸收，或在紫外光區(qū)雖有吸收但為了避免干擾或提高靈敏度，加人適當(dāng)?shù)娘@色劑，使反應(yīng)產(chǎn)物的*大吸收移至可見光區(qū)。
用比色法測定時(shí)，由于顯色時(shí)影響顯色深淺的因素較多，應(yīng)取供試品與對(duì)照品或標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)操作。除另有規(guī)定外，比色法所用的空白系指用同體積的溶劑代替對(duì)照品或供試品溶液，然后依次加入等量的相應(yīng)試劑，并用同樣方法處理。
當(dāng)吸光度和濃度關(guān)系不呈良好線性時(shí)，應(yīng)取數(shù)份梯度量對(duì)照品溶液，用溶劑補(bǔ)充至同一體積，顯色后測定各份溶液的吸光度，然后以吸光度與相應(yīng)的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)供試品的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得其相應(yīng)的濃度，并求出其含量。
5、注意事項(xiàng)
1.試驗(yàn)中所用的量瓶和移液管均應(yīng)經(jīng)檢定校正、洗凈后使用。
2.使用的石英吸收池必須潔凈。當(dāng)吸收池中裝人同一溶劑，在規(guī)定波長測定各吸收池的透光率，如透光率相差在0.3%以下者可配對(duì)使用，否則必須加以校正。
3.取吸收池時(shí)，手指拿毛玻璃面的兩側(cè)。裝樣品溶液的體積以池體積的45為度，使用揮發(fā)性溶液時(shí)應(yīng)加蓋，透光面要用擦鏡紙由上而下擦拭干凈，檢視應(yīng)無殘留溶劑，為防止溶劑揮發(fā)后溶質(zhì)殘留在池子的透光面，可先用醛有空白溶劑的擦鏡紙擦拭，然后再用干擦鏡紙拭凈。吸收池放人樣品室時(shí)應(yīng)注意每次放人方向相同。使用后用溶劑及水沖洗干凈，晾干，防塵保存，吸收池如污染不易洗凈時(shí)可用硫酸發(fā)煙硝酸(31VV)混合液稍加浸泡后，洗凈備用。如用鉻酸鉀清潔液清洗時(shí)，吸收池不宜在清潔液中長時(shí)間浸泡，否則清潔液中的鉻酸鉀結(jié)晶會(huì)損壞吸收池的光學(xué)表面，并應(yīng)充分用水沖洗，以防鉻酸鉀吸附于吸收池表面。
4.含有雜原子的有機(jī)溶劑，通常均具有很強(qiáng)的末端吸收。因此，當(dāng)作溶劑使用時(shí)，它們的使用范圍均不能小于截止使用波長。例如甲醇、乙醇的截止使用波長為205nm。另外，當(dāng)溶劑不純時(shí)，也可能增加干擾吸收。因此，在檢查所用的溶劑在供試品所用的波長附近是否符合要求，即將溶劑置1 cm石英吸收池中，以空氣為空白(即空白光路中不置任何物質(zhì))測定其吸光度，溶劑和吸收池的吸光度應(yīng)符合表3規(guī)定。
5.稱量應(yīng)按規(guī)定要求。配制測定溶液時(shí)稀釋轉(zhuǎn)移次數(shù)應(yīng)盡可能少，轉(zhuǎn)移稀釋時(shí)所取容積一般應(yīng)不少于5m1。含量測定時(shí)供試品應(yīng)稱取2份，如為對(duì)照品比較法，對(duì)照品一般也應(yīng)稱取2份。吸收系數(shù)檢查也應(yīng)稱取供試品2份，平行操作，每份結(jié)果對(duì)平均值的偏差應(yīng)在±0.5%以內(nèi)。作鑒別或檢查可取樣品1份。
6.供試品溶液的濃度，除各品種項(xiàng)下已有注明者外，供試品溶液的吸光度以在0.3~0.7之間為宜，吸光度讀數(shù)在此范圍誤差較小，并應(yīng)結(jié)合所用儀器吸光度線性范圍，配制合適的讀數(shù)濃度。
7.選用儀器的狹縫譜帶寬度應(yīng)小于供試品吸收帶半高寬的1000，否則測得的吸光度值會(huì)偏低，或以減小狹縫寬度時(shí)供試品溶液的吸光度不再增加為準(zhǔn)，對(duì)于紫外分光光度法測定的大部分品種，可以使用2nm縫寬，但當(dāng)吸收帶的半高寬小于20nm時(shí)，則應(yīng)使用較窄的狹縫，例如青霉素鉀及鈉的吸光度檢查需用1nm縫寬或更窄，否則其264nm的吸光度會(huì)偏低。
8.測定時(shí)除另有規(guī)定者外，應(yīng)在規(guī)定的吸收峰±2nm處，再測幾點(diǎn)的吸光度，以核對(duì)供試品的吸收峰位置是否正確，并以吸光度*大的波長作為測定波長，除另有規(guī)定外吸光度*大波長應(yīng)在該品種項(xiàng)下規(guī)定的波長±2nm以內(nèi)，否則應(yīng)考慮試樣的同一性、純度以及儀器波長的準(zhǔn)確度。
9.用于制劑含量測定時(shí)，應(yīng)注意供試液與對(duì)照液的pH值是否一致，如pH值對(duì)吸收有影響，則應(yīng)調(diào)溶液的pH值一致后再測定吸光度。
6、結(jié)果計(jì)算
6.1對(duì)照品比較法
可根據(jù)供試品溶液及對(duì)照品溶液的吸光度與對(duì)照品溶液的濃度以正比法算出供試品溶液的濃度，再計(jì)算含量。
c樣品=A樣品×c對(duì)照A對(duì)照
式中A為吸光度值;
c為測試液濃度(以mgml計(jì))。
6.2吸收系數(shù)法
規(guī)定的吸收系數(shù)，系指E，即在指定波長時(shí)，光路長度為1 cm，試樣濃度換算為1%（gml)時(shí)的吸光度值，故應(yīng)先求被測樣品的E值，再與規(guī)定的E標(biāo)準(zhǔn)值比較，可計(jì)算出供試樣品的含量。
E=Acl
式中A為供試品溶液測得的吸光度值;
c為供試品溶液的百分濃度，即100m1中所含溶質(zhì)的克數(shù)(gml);
l為吸收池的光路長度(cm)。
供試品的含量%=EE標(biāo)準(zhǔn)100
式中E(樣品，為根據(jù)前式計(jì)算出的供試品吸收系數(shù);
E標(biāo)準(zhǔn)為標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的吸收系數(shù)。
7、吸收系數(shù)測定法
本法主要用于新品種的吸收系數(shù)測定。
7.1測定方法
取精制樣品精密稱取一定量，使樣品溶液配成吸光度讀數(shù)在0.6~0.8之間，置1 cm吸收池中，在規(guī)定波長處按5.8項(xiàng)的規(guī)定測出吸光度讀數(shù)，然后再用同批溶劑將溶液稀釋1倍，使吸光度在0.3~0.4之間，再按上述方法測定。樣品應(yīng)同時(shí)測定2份，同一臺(tái)儀器測定的2份結(jié)果，對(duì)平均值的偏差應(yīng)不超過±0.300，否則應(yīng)重新測定。測定時(shí)，先按儀器正常靈敏度測試，然后再減小狹縫測定，直到減小狹縫吸光值不增加為止，取吸光度不改變的數(shù)據(jù)。再用4臺(tái)不同型號(hào)的儀器復(fù)測。
吸收系數(shù)可根據(jù)朗伯一比爾定律求算，以下例說明。
已知某化合物的分子量為287，用乙醇配成濃度為0.0030%的溶液，在波長297nm處，用1 cm石英池，測得吸光度為0.6139，求E值及摩爾吸收系數(shù)ε值。
7.2測定注意事項(xiàng)
7.2.1樣品應(yīng)為精制品，水分或干燥失重應(yīng)另取樣測定并予以扣除。
7.2.2所用的容量儀器及分析天平應(yīng)經(jīng)過檢定，如有相差應(yīng)加上校正值。
7.2.3測定所用的溶劑，其吸光度應(yīng)符合規(guī)定。吸收池應(yīng)于臨用時(shí)配對(duì)或作空白校正。
7.2.4稱取樣品時(shí)，其稱量準(zhǔn)確度應(yīng)按規(guī)定要求。
7.2.5所用的分光光度計(jì)應(yīng)經(jīng)過嚴(yán)格檢定，特別是波長準(zhǔn)確度和吸光度精度要進(jìn)行校正。要注明測定時(shí)的溫度。
